Para crear una planta transgénica primero debe identificarse y aislarse el gen que produce la característica que se desea incorporar en la misma, luego el gen de interés es clonado en un organismo vector (bacteria) para obtener muchas copias.
El tercer paso de la transformación consiste en diseñar el gen que se va a introducir. Los genes necesitan para expresarse una secuencia promotora y una terminadora, además de la región codificante, la cual lleva las instrucciones para la fabricación de la proteína. Como los promotores son específicos para cada organismo hay que reemplazarlos por otros que se expresen en la planta, como por ejemplo el promotor del virus del mosaico de la coliflor, que se expresa en todos los tejidos del vegetal o el promotor de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, que pertenece a una enzima fotosíntetica y sólo se expresa en los tejidos verdes de la misma. También debe incorporarse una secuencia de ADN que permita identificar las células que han sido transformadas. Para ello se utilizan genes de resistencia a antibióticos, herbicidas u otros genes marcadores, que luego se expresarán en el medio adecuado y mostrarán aquellas células que han incorporado exitosamente el transgén.
La última etapa de este proceso es la incorporación del transgén a la planta. Para ello existen diversas metodologías, aunque son solamente dos las más utilizadas: transferencia directa o método de biobalística y transferencia mediada por un vector
TRANSFERENCIA DIRECTA DE GENES:....
Esta metodología fue inventada en la Universidad de Cornell en la década de los 80 y permite la introducción de ADN en células que se hallan en cultivo. Se recubren micropartículas (0,4-0,2 micrómetros de diámetro) de oro o tungsteno con el ADN que se desea introducir en la planta y se disparan con una “pistola” que funciona, generalmente, con gas helio. La incorporación del ADN en las células es al azar y varía con la distancia y la fuerza del disparo.
TRANSFERENCIA DE GENES UTILIZANDO UN VECTOR:
Agrobacterium tumefaciens es una bacteria del suelo que infecta naturalmente a muchas especies vegetales y produce una enfermedad conocida como “agalla de corona”, debido a la proliferación de tejido en el vegetal que simula un tumor. Estudiando el mecanismo de infección de la bacteria se demostró que ésta incorporaba en el genoma vegetal una porción de su ADN plasmídico.
Este plásmido, llamado Ti (inductor de tumores) introduce de manera estable en la célula vegetal una porción de su ADN, el ADN-T (ADN transferible), portador de la información genética necesaria para que la planta produzca sustancias necesarias para la vida del patógeno (opinas) y ciertas hormonas vegetales como auxinas y citocininas responsables de la proliferación celular y la consiguiente formación del tumor.
A partir de este descubrimiento y con la disponibilidad de las enzimas de restricción, se pudo “desarmar” (eliminarle la capacidad de producción de tumor) el plásmido Ti e incorporarle ciertos genes de interés para introducirlos en las células vegetales.
La obtención de una planta transgénica por cualquiera de estos dos métodos dependerá de la inserción del gen de interés en el genoma de la misma, de su expresión y de la transmisión del mismo a su descendencia como si fuera propio, además de la posibilidad de regenerar la planta in Vitro.
Luego de la transformación los tejidos vegetales deben transferirse a un medio de cultivo “selectivo” que contiene el antibiótico o herbicida cuya resistencia codifica el gen marcador, para que solamente crezcan las plantas que han sido transformadas.
Los tejidos que sobreviven a la selección se cultivan en condiciones ambientales controladas agregando al medio hormonas y nutrientes esenciales para la generación de una planta completa. A éstas se les hacen diversas evaluaciones como expresión correcta del gen, transmisión del mismo a la descendencia, entre otras.
Una vez obtenida una línea o variedad transgénica, la característica de interés puede ser introducida en otras por medio de retrocruzas, es decir por técnicas de mejoramiento genético convencional.
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